点击图片查看原图
脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫(ELISA)
快速检测试剂盒
1、简介
本试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附ELISA原理快速定量检测小麦、玉米和饲料等样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）。
小麦、玉米、饲料的前处理包括：提取、过滤、稀释，处理时间大约为20-40分钟。
本试剂盒的检测限为：0.2 ppm；小麦、玉米、饲料中DON的回收率 ≥80%；批内、批间变异系数 <15%。
2、试剂盒组成
A. 48孔DON酶标板------------------------------------------------------------ 8孔×6条
B. 20×浓缩洗涤液：25 mL (用蒸馏水稀释20倍使用)--------------------------1瓶
C. DON抗体：4 mL---------------------------------------------------------------------1瓶
D. 酶标二抗：6 mL---------------------------------------------------------------------1瓶
E. 显色液：6 mL ------------------------------------------------------------------------1瓶
F. 终止液：3 mL-------------------------------------------------------------------------1瓶
G. DON标准品：1 mL/瓶（0、0.5、1.0、2.0、4.0 ppm）-----------------各1瓶
H.说明书 ---------------------------------------------------------------------------------1份
注意：标准品含有DON、终止液含2 N H2SO4，需小心取用。请勿在有效期外使用本试剂盒或将不同批次的试剂混用。DON标准品的实际浓度为0、50、100、200、400 ng/mL。
3、贮存条件与有效期
2-8℃避光贮存，忌0℃以下冻存。未开封试剂盒有效期为12个月，开封后3个月内用完（见包装盒上标签有效期）。
4、样品处理程序
4.1脂肪含量低的固体样品（如大米、玉米和小麦等）
4.1.1称取5 g粉碎样品于100 mL带塞三角瓶内，准确加入25 mL超纯水
或蒸馏水。
4.1.2将加入水的样品放入振荡器内（或用手强力振荡），充分振荡3分钟
后，用定性滤纸过滤，收集滤液。
4.1.3取滤液4 mL，加入4 mL 超纯水或蒸馏水，混匀，用定性滤纸过滤，
滤液为样品待检液。
4.2啤酒、麦芽汁
取5 mL样品于100 mL带塞三角瓶内，准确加入45 mL纯水或蒸馏水，混匀，用定性滤纸过滤，该溶液为样品待检液。
注意：
某些样品待检液久置影响检测结果的准确性，为保证检测的准确性，样品提取后请即时检测。
若样品待检液不立即检测，请将其存储于棕色玻璃瓶内，2-8℃避光保存。
试剂盒在使用前，请将试剂盒内所有试剂放到室温（20-25℃）进行温度平衡；试剂用完后立即将其放置回2-8℃冰箱内保存。
在每个步骤操作时，速度要快，不要使板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于原铝箔袋内，防止受潮且保存于2-8℃冰箱内。
在温育时，避免光照，建议将酶标板置于湿盒内(在有盖容器内放置一块平整湿纱布)进行温育。
若样品数量超过20份，请用多通道加样器操作。
5、定量检测程序
5.1 实验准备：从冰箱取出试剂盒，恢复至室温后，打开铝箔袋，取出所需数
量的板条插入微孔架，记录空白、DON标准品①②③④⑤号及样品的位置（可参照下表所示）。其余板条封口后放入冰箱。将20×浓缩洗涤液用超纯
水或蒸馏水稀释20倍，待用。
|
|
1
|
2
|
3-12
|
|
A
|
空白
|
样品
|
|
|
B
|
标准品①
|
样品
|
|
|
C
|
标准品②
|
样品
|
|
|
D
|
标准品③
|
样品
|
|
|
E
|
标准品④
|
样品
|
|
|
F
|
标准品⑤
|
样品
|
|
|
G
|
样品
|
样品
|
|
|
H
|
样品
|
样品
|
|
5.2加样：空白孔加入100 µL 洗涤液(不加DON抗体)，DON标准品孔和样品
孔相应地加入标准品(①②③④⑤)和样品待检液50 µL（如上表所示加入），再加入DON抗体(50 µL )，此时各孔中溶液体积为100 µL。将酶标板在水平桌面上轻微振荡（注意避免液体溅出）使之混匀，放入湿盒内(在有盖容器内放置一块平整湿纱布)，37℃温育30分钟。
注意：此操作步骤要快，尽量保持前后孔温育时间一致，每次加样须更换新
的吸头。
5.3洗板：甩出孔中的液体，用洗瓶或移液器将洗涤液加入各孔中(满孔)，再次甩出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤三次(共洗四次)。
5.4加酶标二抗：将洗好的酶标板平放，加入酶标二抗100 µL /孔，将酶标板置于湿盒内， 37℃温育30分钟。
5.5洗板：参照5.3
5.6显色：将洗好的酶标板平放，加入显色液100 µL /孔，37℃显色5分钟(若显色较浅，可适当延长，但不宜超过10分钟)。
5.7终止及测定：将显色完毕的酶标板取出，加入终止液50 µL/孔，轻微震荡混匀，以空白孔调零，在450 nm处测量吸光值A（在加入终止液5分钟内读取光度值）。
5.8结果判定：以DON标准品浓度0.5ppm、1.0ppm、2.0ppm、4.0ppm的常用对数值（1gC）为横坐标，各浓度标准品相应的吸光值A与0ppm的标准品A值的比值(B/B0%)为纵坐标[B/B0%=标准品（或样品）的吸光值/0ppm标准品的吸光值×]，绘制标准曲线。根据样品孔的吸光值计算样品的B/B0%值，查标准曲线，可得到相应样品中DON的含量(已考虑样品提取的稀释倍数，结果无需换算)。(或可直接用RADEWIN 等ELISA分析软件对数据进行分析得出结果)。如果检测结果高于检测上限，请将待测样品提取液用超纯水或蒸馏水稀释后再检测，测定结果乘以相应的稀释倍数。
6、限量(定性)检测程序
样品处理程序见4，适用于同时定性检测多个限量标准不同的样品，以DON标准品③号(1.0ppm)作参照进行定性比较，不需作标准曲线。
6.1实验准备：从冰箱取出试剂盒，恢复至室温后，打开铝箔袋，取出所需数量的板条插入微孔架，记录空白、DON标准品③号(1.0ppm)及样品的位置，其余板条封口后放入冰箱。
6.2反应：空白孔加入100 µL 洗涤液(不加DON抗体)。DON标准品孔和样品孔相应地加入标准品③号(1.0ppm)和待检样品提取液各50 µL，再加入DON抗体(50 µL )，此时各孔中溶液体积为100 µL。将酶标板在水平桌面上轻微振荡（注意避免液体溅出），使之混匀，放入湿盒内(在有盖容器内放置一块平整湿纱布)，37℃温育30分钟。
注意：此操作步骤要快，尽量保持前后孔温育时间一致，每次加样须更换新
的吸头。
6.3洗板：参照5.3
6.4加酶标二抗：参照5.4
6.5洗板：参照5.5
6.6显色：参照5.6
6.7终止及测定：参照5.7 (目测法不加终止液)
6.8结果判定：目测法(未加终止液前目测)：比较样品孔与标准品参照孔的颜色，若显色比标准品参照浅者，则为阳性，样品中DON的含量超出限量标准；若深者，则为阴性；若颜色接近，则需用酶标仪测吸光值比较。仪器法：酶标仪检测在450 nm波长处各孔的吸光值A，若样品的A值<标准参照的A值，为阳性，表示样品中DON的含量超出限量标准；若样品A值≥标准参照A值，为阴性。
7、自备仪器及试剂
7.1 酶标仪（内置450 nm滤光片）或黄曲霉毒素B1测定仪。
7.2 20-200 uL微量移液器及配套吸头。
7.3恒温培养箱（0℃-50℃）。
7.4冰箱。
7.5感量0.01g的天平。
7.6小型粉碎机或碾钵。
7.7玻璃器皿：三角瓶、量筒、具塞试管、滴管、移液管等
7.8其他：滤纸、吸水纸等。
8、国家标准
GB/T 14929.594 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法：薄层色谱和ELISA法。
GB 163291996 小麦、面粉、玉米及玉米粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准为1000 µg/kg。